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高效液相色谱法测定牛樟芝中腺苷的含量

* 来源 : * 作者 : admin * 发表时间 : 2017-09-08 * 浏览 : 9

作者:程利娟

北京军区联勤部药品仪器检验所

解放军医药杂志 20145 26 5

文章编号 2095-140X( 2014) 05-0076-03

摘要

目的  采用高效液相色谱法测定牛樟芝中腺苷的含量。

方法  色谱柱: Agilent Zorbax SB-C18( 4. 6 mm X 250 mm5 μm) 流动相: 乙腈- 0.01 mol /L 磷酸二氢钾溶液( 6 94) ,流速: 1. 0 ml/min,检测波长: 260 nm,柱温: 30℃,进样量: 10 μl

结果  腺苷在2.696 67.40 g /ml 范围内与其峰面积呈现良好的线性关系( r = 0.999 9) ,平均回收率为99.89%,相对标准偏差为1.71%( n = 6)

结论  该方法简便准确,灵敏度高,重复性好,为控制牛樟芝的质量提供了科学依据。


牛樟芝( Antrodiacamphorata) 又名牛樟菇、樟菇、樟芝、阴阳对口菇、灵芝之王、血灵芝、棺花,为台湾地区特有真菌品种,具有抗肿瘤、增加免疫能力、抗细菌、抗病毒、抗过敏、抗高血压、降血糖、降胆固醇、抑制血小板凝集及保护肝脏等生理活性,而且不良反应很少[1-2]

现代科学研究表明,牛樟芝含有三萜类化合物、多糖、腺苷、超氧歧化酶、有机锗、蛋白质( 含免疫蛋白) 、维生素、烟碱酸、麦角固醇等多种有效成分[3]

腺苷作为牛樟芝重要活性成分之一,能够降低体外循环后肺缺血- 再灌注损伤,有效改善右心功能,对再灌注心脏具有保护作用,同时提高血液供氧能力和加速血液微循环,提高血液对心脑的供氧能力[4-8],是牛樟芝发挥药理作用的主要成分之一,但目前尚未见以腺苷作为牛樟芝内在质量评价指针的相关报导。

为了进一步严格控制中药材的质量,确保临床用药的有效性,本实验采用高效液相色谱法测定牛樟芝中腺苷的含量,以期为牛樟芝的质量控制提供参考。


腺苷分子式


1 仪器与试药

Agilent 1100 型高效液相色谱仪( 包括四元泵,VWD 检测器,自动进样器,ChemStation 化学工作站) ; Mettler-Toledo AX205 电子天平( 梅特勒- 托利多仪器有限公司) ; KQ-300VDB 型双频数控超声波清洗器( 昆山超声仪器有限公司)

腺苷对照品( 中国药品生物制品检定所,批号:110879-200202) ,牛樟芝药材 ,甲醇、磷酸二氢钾、乙腈为色谱纯,水为超纯水,其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2. 1 色谱条件Agilent Zorbax SB-C18色谱柱( 4. 6 mm × 250 mm,5 μm ) ,流动相: 乙腈-0. 01 mol /L 磷酸二氢钾溶液( 6 94 ) ,流速:1. 0 ml /min,检测波长: 260 nm,柱温: 30℃,进样量:10μl

2. 2 系统适应性试验在上述色谱条件下,腺苷色谱峰的理论塔板数> 10 000,分离度为2. 95,拖尾因子为0.97,色谱图见图1

1 腺苷( A) 和牛樟芝样品( B) 的高效液相色谱图


2. 3 溶液的制备

2. 3. 1 对照品溶液制备: 精密称取腺苷对照品13. 48 mg,加15% 甲醇定容至100 ml,制成浓度为134. 8 μg /ml的对照品储备液,置4 C 冰箱保存。

2. 3. 2 供试品溶液制备: 取牛樟芝粉末( 过三号筛) 1. 0 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入15%甲醇25 ml,密塞,称定重量,超声处理( 功率300 W,频率45 kHz) 30 min,放冷,再称定重量,用15%甲醇补足减失的重量,摇匀0. 45μm微孔滤膜滤过,取续滤液,即得。

2. 4 线性关系考察精密量取腺苷对照品储备液0. 21. 02. 03. 05. 0 ml 分别置于10 ml 量瓶中,加15% 甲醇定容,摇匀,制成浓度分别为2. 69613. 4826. 9640. 4467. 40 μg /ml 的标准品溶液,按"2. 1"项下色谱条件测定峰面积,以浓度为横坐标( X) ,峰面积为纵坐标( Y) ,绘制标准曲线,得回归方程: Y = 32. 499X + 0. 1498( r = 0. 999 9n = 6) ,表明腺苷在2. 696 67. 40 μg /ml 范围内与其峰面积呈良好的线性关系。

2. 5 精密度试验精密吸取浓度为40. 44 μg /ml的对照品溶液,按2. 1"项下色谱条件连续进样6次,峰面积的相对标准偏差( SD) 0. 58%,表明仪器的精密度良好。

2. 6 稳定性试验取同一供试品溶液,分别在02481224 h 2. 1"项下色谱条件测定,记录峰面积,结果腺苷峰面积的RSD 0. 99% ( n = 6) ,表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

2. 7 重复性试验取同一批样品6 份,按"2. 3. 2"项下方法制成供试品溶液,进样测定,结果样品中腺苷平均含量为1. 18 mg /g,RSD 0. 93%,表明该方法重复性良好。

2. 8 加样回收率测定精密称取6 份已知含量1. 18 mg /g) 的牛樟芝样品( 批号20121025) 0. 1 g,分别精密加入40. 44 μg /ml 的腺苷对照品溶液3. 0 ml,按2. 3. 2"项下方法制成供试品溶液,测定腺苷含量,计算回收率,结果见表1

2. 9 样品含量测定按2. 3. 2"项下方法制备供试品溶液,按2. 1"项下色谱条件测定3 批样品的含量,每份样品平行测定3 份,结果腺苷的含量分别为1.181. 271. 21 mg /g,RSD 分别为0.97%1. 27%1.14%

3 讨论

3. 1 流动相的选择采用高效液相色谱法测定腺苷含量的报导较多,以甲醇- 磷酸二氢钾体系较多见,但是分析时间较长[9-18]。参考其他文献,发现乙腈- 磷酸二氢钾体系也常用于腺苷含量的测定[19-23]

研究比较发现,乙腈- 磷酸二氢钾溶液作为流动相体系的基线较甲醇- 磷酸二氢钾体系稳定,通过比较乙腈- 0. 01 mol /L 磷酸二氢钾溶液、乙腈- 0. 02mol /L 磷酸二氢钾溶液、乙腈-0.05 mol /L磷酸二氢钾溶液等多种流动相体系,发现乙腈- 0.01 mol /L 磷酸二氢钾溶液效果最好,而高比例磷酸盐的存在可能对泵和色谱柱造成损害[24]

3. 2 色谱柱的选择通过对Agilent Zorbax SB-C18Agilent Zorbax SB-C8Agilent Eclipse XDB-C18多个不同填料色谱柱用于腺苷的分离效果进行比较,发现腺苷在Agilent Zorbax SB-C18色谱柱的分离效果最好,故选择Agilent Zorbax SB-C18开展试验。

3. 3 提取溶剂的选择通过比较甲醇、45% 甲醇、15%甲醇、水4 种不同提取溶剂对试验的影响发现,提取溶剂为15% 甲醇时,腺苷的提取量较高,色谱图中杂质峰的影响较小,可能是由于牛樟芝中含有大量多糖成分,在使用甲醇处理时多糖和其他大分子物质发生沉淀,情况得到改善,因此,选择15% 甲醇为提取溶剂。

人工栽培牛樟芝药用价值较高,但价格昂贵,因此通过测定有效成分的含量,对培养条件、培养方式进行优化显得尤为重要,可进一步保证和提高牛樟芝产品的质量。

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