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高效毛细管电泳法同时测定牛樟芝中5种核苷类成分的含量

* 来源 : * 作者 : admin * 发表时间 : 2017-09-25 * 浏览 : 8

2017-09-20 张奉苏 生物技术与健康快讯

牛樟芝( Antrodia camphorata) 又称樟芝、牛樟菇、樟内菇、红樟菇等,是只生长于我国台湾省牛樟树( Cinnamomum kanehirai ) 腐朽内壁的多孔真菌[1]。

 

现代研究表明,樟芝含有多糖、三萜、超氧化物歧化酶( SOD) 、腺苷、小分子蛋白质( 含免疫蛋白) 等多种生理活性物质[2-7]。

 

近年来,核苷类成分已被证实是重要的生物活性物质,具有抗惊厥、抗血小板聚集、抗氧化活性[8-9]。作为新兴名贵食、药用菌,目前我国台湾及日本已有樟芝保健食品上市,并作为食品进口销往内地市场。

 

迄今,有关牛樟芝的质量研究报道较少,仅见多糖、三萜类成分分析的零星报道,尚未见核苷类成分测定的报道。

 

毛细管电泳原理图

 

毛细管电泳技术作为一种新型分析技术,兼有电泳和色谱技术的双重优点,因而具有高效、高速、高灵敏度、高自动化以及样品和试剂耗用量少等一系列优点[10],已较为广泛地应用于中药指标成分含量分析研究[11]。

 

本实验在前期研究基础上[12 13],建立HPCE 同时测定牛樟芝中腺嘌呤、腺苷、尿苷、鸟苷及肌苷5 种核苷类成分含量的方法,并对不同批次商品牛樟芝进行比较分析,为牛樟芝内在质量的综合评价和全面控制提供可靠的检测方法。

 

 

1 仪器与材料

仪器  G1600AX 高效毛细管电泳仪( 美国Agilent公司) ,配惠普化学工作站,二极管阵列检测器( DAD) ,自动进样器; Anke TGL16B 离心机( 上海安亭科学仪器厂) ; YP601N 电子天平( 上海精密科学仪器有限公司) ; HHS 型水浴锅( 巩义市英峪予华仪器厂) ; KQ500B 型超声波清洗器( 昆山市超声仪器有限公司,超声功率500 W) ; pHS3C pH( 上海康仪仪器有限公司)

 

高效毛细管电泳仪(一体机)

 

对照品   腺嘌呤( adenine,批号: 110886-200001) 、腺苷( adenosine,批号: 110879-200202) 、肌苷( inosine,批号: 140669-201104) 、尿苷( uridine,批号: 110887-200202) 购于中国药品生物制品检定所;鸟苷( guanosine,批号: 1001103046) 购于美国Sigma公司,纯度大于98%。硼砂、氢氧化钠为分析纯,实验用水均为重蒸馏水。

 

牛樟芝样品S1 S10 为台湾某生物科技股份有限公司提供,批号分别为: 02L0702L1102L1402L1802L2102L2502L2803L0403L07 03L11。留样凭证存放于南京中医药大学中药鉴定实验室。

 

2 方法与结果

2. 1 电泳条件

 

未涂渍标准熔融石英毛细管75 μm × 64. 5 cm,有效长度56 cm( Agilent 科技有限公司) ; 运行缓冲液: 60 mmol·L 1 硼砂( pH 9. 3) ; 检测波长: 260 nm;分离电压: 22 kV; 压力进样: 50 mbar × 6 s; 毛细管温度: 28 ℃。

 

毛细管使用前依次用0. 1 mmol·L 1氢氧化钠溶液、重蒸馏水和运行缓冲液压力冲洗5105min,样品分析间隔用0. 1 mmol·L 1 氢氧化钠溶液、重蒸馏水、缓冲液平衡355 min。上述试剂使用前均经0. 22 μm 滤膜滤过,并超声脱气。

 

2. 2 对照品溶液制备

精密称定腺嘌呤10. 30 mg,腺苷9. 98 mg,尿苷10. 00 mg,鸟苷8. 08 mg,肌苷10. 24 mg,分别置于10 mL 量瓶中,加水溶解并定容至刻度,得到各对照品母液。

 

分别取腺嘌呤0. 5 mL、腺苷2. 5 mL、尿苷2. 5 mL、鸟苷1. 25 mL 及肌苷0. 625 mL 母液至25mL 量瓶中,加水定容至刻度,制成腺嘌呤、腺苷、尿苷、鸟苷、肌苷质量浓度分别为20. 699. 8100. 040. 425. 6 μg·mL–1的混合对照品储备液。

 

2. 3 供试品溶液制备

取经50 ℃干燥48 h 后的样品粉末0. 5 g,精密称定,加蒸馏水5 mL 超声( 40 kHz 500 W) 提取40 min,沸水加热10 min 12 000 r·min 1离心8 min,取上清液,用0. 22 μm 滤膜过滤,作为供试品溶液。

 

2. 4 标准曲线、检测限与定量限

精密吸取混合对照品溶液0. 51234 mL 5 mL 量瓶中,用蒸馏水定容至刻度,将上述不同浓度混合对照品溶液及混合对照品储备液进样测定,以对照品的峰面积( Y) 对相应的质量浓度( ρ) 进行线性回归,得回归方程、相关系数及线性范围;

 

以各化合物的信噪比等于3( S /N = 3) 时的相应浓度确定最低检测限( LOD) ; 以各化合物的信噪比等于10( S /N = 10) 时的相应浓度确定最低定量限( LOQ) 。结果见表1

 

 

2. 5 系统适用性实验

在选定的条件下注入供试品溶液,按n = 5. 54( tR /Wh/2) 2分别计算色谱柱理论塔板数n; R = 2( tR2 tR1) /( W1 + W2) 分别计算分离度R。结果表明,理论塔板数、分离度均达到相关要求。结果见表2,图1

 

1 混合对照品( A) 和牛樟芝样品( B) HPCE-DAD 色谱图

Fig. 1 HPCE-DAD Chromatograms of mixed standards( A) andAntrodia camphorate

 

2. 6 方法学考察

精密度实验:取混合对照品溶液,重复进样5次,考察日内精密度; 连续3 d,进样分析考察日间精密度,测得各对照品平均迁移时间、峰面积的相对标准偏差( RSD) 均分别小于1.34%5.87%

 

稳定性实验:取供试品( S1) 溶液,分别在1481624 h 进样5 次,测得5 种核苷的平均迁移时间、峰面积的相对标准偏差( RSD) 均小于1.18%5.18%

 

重复性实验:精密称取供试品( S1) 5 份,每份0. 5 g,分别按供试品溶液制备方法制备供试液,进样测定,腺嘌呤、腺苷、尿苷、鸟苷及肌苷的平均含量分别为18. 111887. 24956. 43749. 28100. 24 μg·g 1 ; RSD 分别为2.38%4. 96%1. 88%2. 67%3. 24%

 

加样回收率实验:取已知含量的样品( S1) 0. 25 g( 5) ,精密称定,分别精密加入一定量的腺嘌呤、腺苷、尿苷、鸟苷及肌苷对照品,按“2. 3”制备方法制备加样回收供试品液,并按样品测定方法进行测定,计算回收率,结果表明,腺嘌呤、腺苷、尿苷、鸟苷及肌苷的平均回收率分别为98. 83%99. 83%101. 04%99. 65%101. 08%; RSD 分别为3. 18%1. 75%2. 61%2. 82%3. 27%,结果见表3

 

 

2. 7 样品分析

在选定的电泳优化条件下,将供试品溶液注入高效毛细管电泳仪,进行测定。根据相应线性关系计算样品中腺嘌呤、腺苷、尿苷、鸟苷及肌苷的含量。结果见表4

 

 

3 讨论

3. 1 泳条件优化

 

缓冲液的选择:实验考察了硼砂、硼砂-硼酸、硼砂-甲醇、硼砂-氨水、乙酸钠-乙酸铵、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠体系的缓冲液,发现选用乙酸钠-乙酸铵缓冲液或磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液,5 种核苷分离度很差,基本不能分开; 选用硼砂-硼酸液分离效果稍好,但仍有一些峰达不到基线分离; 当选用硼砂-甲醇及硼砂-氨水时,分离效果一般。

 

经反复实验确定以硼砂为缓冲液,5 种核苷分离效果最好。故选择硼砂缓冲体系。

 

缓冲液浓度的选择:实验考察了60 70mmol·L 1的硼砂缓冲溶液,结果发现,迁移时间和分离度随着缓冲液浓度的升高而减小。

 

当缓冲液浓度为60 mmol·L 1时,样品各组分的峰形和分离度较好,故选择缓冲液的浓度为60 mmol·L 1

 

缓冲液pH 的选择:缓冲液pH 是影响组分迁移时间及分离度的重要因素,实验考察了pH 9. 08 9. 30 的缓冲液,发现随着pH 值的增大,各组分的分离度增加而迁移时间延长,峰高亦增高,当pH 9. 30 5 种核苷组分可达到基线基本分离,样品各组分分离较好。故选择缓冲液的pH 9. 30

 

运行电压的选择:实验考察了分离电压在15 24 kV的条件下对各组分迁移时间的影响,实验结果表明,分离电压过小,不能达到很好分离,当分离电压为22 kV 时样品中各组分分离度较好,5种核苷可以达到基线分离。故选择分离电压为22 kV

 

检测波长的选择:采用二极管阵列检测器对检测波长进行考察,记录并比较不同波长的色谱图,根据分析物的紫外吸收特征,发现在260 nm 波长处,5种核苷类成分均有较好的吸收,故选择260 nm 为检测波长。

 

3. 2 实验结果分析

含量测定结果表明,不同批次牛樟芝样品中5种核苷类成分的含量有所差异。腺嘌呤以S1 含量较高,腺苷以S3 含量较高,尿苷以S4S7 含量较高,鸟苷以S3S10 含量较高,肌苷S4S7 含量较高,这可能与培养基质、培养条件等有关。

 

牛樟芝样品中5 种核苷的含量高低顺序总体为: 腺苷> 尿苷> 鸟苷> 肌苷> 腺嘌呤,其核苷含量变化规律仍需要进一步实验探讨。综上所述,核苷可作为评价牛樟芝质量稳定和均一性的一项重要指标。

 

 

4 结论

本实验建立了HPCE 同时测定牛樟芝中腺嘌呤、腺苷、尿苷、鸟苷及肌苷等5 种核苷类成分含量的方法,本方法准确、可靠,重现性较好,可用于牛樟芝内在质量的评价和控制。

 

 

作者  张奉苏

南京中医药大学江苏省中药炮制重点实验室

中国药学杂志2013 6 月第48 卷第12

 

参考文献

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