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高效液相色譜法測定牛樟芝中腺苷的含量

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作者:程利娟

北京軍區聯勤部藥品儀器檢驗所

解放軍醫藥雜誌 20145 26 5

文章編號 2095-140X( 2014) 05-0076-03

摘要

目的  採用高效液相色譜法測定牛樟芝中腺苷的含量。

方法  色譜柱: Agilent Zorbax SB-C18( 4. 6 mm X 250 mm5 μm) 流動相: 乙腈- 0.01 mol /L 磷酸二氫鉀溶液( 6 94) ,流速: 1. 0 ml/min,檢測波長: 260 nm,柱溫: 30℃,進樣量: 10 μl

結果  腺苷在2.696 67.40 g /ml 範圍內與其峰面積呈現良好的線性關係( r = 0.999 9) ,平均回收率為99.89%,相對標準差為1.71%( n = 6)

結論  該方法簡便準確,靈敏度高,重複性好,為控制牛樟芝的品質提供了科學依據。


牛樟芝( Antrodiacamphorata) 又名牛樟菇、樟菇、樟芝、陰陽對口菇、靈芝之王、血靈芝、棺花,為臺灣地區特有真菌品種,具有抗腫瘤、增加免疫能力、抗細菌、抗病毒、抗過敏、抗高血壓、降血糖、降膽固醇、抑制血小板凝集及保護肝臟等生理活性,而且不良反應很少[1-2]

現代科學研究表明,牛樟芝含有三萜類化合物、多糖、腺苷、超氧歧化酶、有機鍺、蛋白質( 含免疫蛋白) 、維生素、煙鹼酸、麥角固醇等多種有效成分[3]

腺苷作為牛樟芝重要活性成分之一,能夠降低體外迴圈後肺缺血- 再灌注損傷,有效改善右心功能,對再灌注心臟具有保護作用,同時提高血液供氧能力和加速血液微循環,提高血液對心腦的供氧能力[4-8],是牛樟芝發揮藥理作用的主要成分之一,但目前尚未見以腺苷作為牛樟芝內在品質評價指標的相關報導。

為了進一步嚴格控制中藥材的品質,確保臨床用藥的有效性,本實驗採用高效液相色譜法測定牛樟芝中腺苷的含量,以期為牛樟芝的品質控制提供參考。


腺苷分子式


1 儀器與試藥

Agilent 1100 型高效液相色譜儀( 包括四元泵,VWD 檢測器,自動進樣器,ChemStation 化學工作站) ; Mettler-Toledo AX205 電子天平( 梅特勒- 托利多儀器有限公司) ; KQ-300VDB 型雙頻數控超聲波清洗器( 昆山超聲儀器有限公司)

腺苷對照品( 中國藥品生物製品檢定所,批號:110879-200202) ,牛樟芝藥材 ,甲醇、磷酸二氫鉀、乙腈為色譜純,水為超純水,其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2. 1 色譜條件Agilent Zorbax SB-C18色譜柱( 4. 6 mm × 250 mm,5 μm ) ,流動相: 乙腈-0. 01 mol /L 磷酸二氫鉀溶液( 6 94 ) ,流速:1. 0 ml /min,檢測波長: 260 nm,柱溫: 30℃,進樣量:10μl

2. 2 系統適應性試驗在上述色譜條件下,腺苷色譜峰的理論塔板數> 10 000,分離度為2. 95,拖尾因數為0.97,色譜圖見圖1

1 腺苷( A) 和牛樟芝樣品( B) 的高效液相色譜圖


2. 3 溶液的製備

2. 3. 1 對照品溶液製備: 精密稱取腺苷對照品13. 48 mg,加15% 甲醇定容至100 ml,製成濃度為134. 8 μg /ml的對照品儲備液,置4 C 冰箱保存。

2. 3. 2 供試品溶液製備: 取牛樟芝粉末( 過三號篩) 1. 0 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入15%甲醇25 ml,密塞,稱定重量,超聲處理( 功率300 W,頻率45 kHz) 30 min,放冷,再稱定重量,用15%甲醇補足減失的重量,搖勻0. 45μm微孔濾膜濾過,取續濾液,即得。

2. 4 線性關係考察精密量取腺苷對照品儲備液0. 21. 02. 03. 05. 0 ml 分別置於10 ml 量瓶中,加15% 甲醇定容,搖勻,製成濃度分別為2. 69613. 4826. 9640. 4467. 40 μg /ml 的標準品溶液,按"2. 1"項下色譜條件測定峰面積,以濃度為橫坐標( X) ,峰面積為縱坐標( Y) ,繪製標準曲線,得回歸方程: Y = 32. 499X + 0. 1498( r = 0. 999 9n = 6) ,表明腺苷在2. 696 67. 40 μg /ml 範圍內與其峰面積呈良好的線性關係。

2. 5 精密度試驗精密吸取濃度為40. 44 μg /ml的對照品溶液,按2. 1"項下色譜條件連續進樣6次,峰面積的相對標準差( SD) 0. 58%,表明儀器的精密度良好。

2. 6 穩定性試驗取同一供試品溶液,分別在02481224 h 2. 1"項下色譜條件測定,記錄峰面積,結果腺苷峰面積的RSD 0. 99% ( n = 6) ,表明供試品溶液在24 h 內穩定性良好。

2. 7 重複性試驗取同一批樣品6 份,按"2. 3. 2"項下方法製成供試品溶液,進樣測定,結果樣品中腺苷平均含量為1. 18 mg /g,RSD 0. 93%,表明該方法重複性良好。

2. 8 加樣回收率測定精密稱取6 份已知含量1. 18 mg /g) 的牛樟芝樣品( 批號20121025) 0. 1 g,分別精密加入40. 44 μg /ml 的腺苷對照品溶液3. 0 ml,按2. 3. 2"項下方法製成供試品溶液,測定腺苷含量,計算回收率,結果見表1

2. 9 樣品含量測定按2. 3. 2"項下方法製備供試品溶液,按2. 1"項下色譜條件測定3 批樣品的含量,每份樣品平行測定3 份,結果腺苷的含量分別為1.181. 271. 21 mg /g,RSD 分別為0.97%1. 27%1.14%

3 討論

3. 1 流動相的選擇採用高效液相色譜法測定腺苷含量的報導較多,以甲醇- 磷酸二氫鉀體系較多見,但是分析時間較長[9-18]。參考其他文獻,發現乙腈- 磷酸二氫鉀體系也常用於腺苷含量的測定[19-23]

研究比較發現,乙腈- 磷酸二氫鉀溶液作為流動相體系的基線較甲醇- 磷酸二氫鉀體系穩定,通過比較乙腈- 0. 01 mol /L 磷酸二氫鉀溶液、乙腈- 0. 02mol /L 磷酸二氫鉀溶液、乙腈-0.05 mol /L磷酸二氫鉀溶液等多種流動相體系,發現乙腈- 0.01 mol /L 磷酸二氫鉀溶液效果最好,而高比例磷酸鹽的存在可能對泵和色譜柱造成損害[24]

3. 2 色譜柱的選擇通過對Agilent Zorbax SB-C18Agilent Zorbax SB-C8Agilent Eclipse XDB-C18多個不同填料色譜柱用於腺苷的分離效果進行比較,發現腺苷在Agilent Zorbax SB-C18色譜柱的分離效果最好,故選擇Agilent Zorbax SB-C18開展試驗。

3. 3 提取溶劑的選擇通過比較甲醇、45% 甲醇、15%甲醇、水4 種不同提取溶劑對試驗的影響發現,提取溶劑為15% 甲醇時,腺苷的提取量較高,色譜圖中雜質峰的影響較小,可能是由於牛樟芝中含有大量多糖成分,在使用甲醇處理時多糖和其他大分子物質發生沉澱,情況得到改善,因此,選擇15% 甲醇為提取溶劑。

人工栽培牛樟芝藥用價值較高,但價格昂貴,因此通過測定有效成分的含量,對培養條件、培養方式進行優化顯得尤為重要,可進一步保證和提高牛樟芝產品的品質。

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